亞氨基二乙酸-瓊脂糖

1 、產品介紹

IDA NUPharose HP 是含亞氨基二乙酸（iminodiacetic acid，IDA）基團的金屬螯合填料，適用于大部分帶組-氨酸標簽（His-tag）蛋白的親和層析。，HP為High Performance的縮寫，意為高分辨，微球的平均粒徑為~35μm。IDANUPharose HP未螯合金屬離子，用戶可螯合Ni2+、Co2+、Cu2+、Zn2+ 等金屬離子后使用。

通過獨-特的配基修飾工藝，這款產品做到了親和力和特異性的平衡：對大部分帶組-氨酸標簽蛋白的結合量大于50 mg/mL的同時，一步純化后樣品純度可達90%以上。

2 、產品特點與技術指標

注：a90%體積以上的微球在此粒徑范圍；bDBC10%測試條件為：10%流穿，大腸桿菌表達帶組-氨酸標簽的重組金黃色-葡萄球菌蛋白A，6 min 停留時間；c 10 cm 柱高下的最大測試流速；d 未螯合金屬離子狀態下的pH 穩定性。

 3 、金屬螯合親和層析——IDA

金屬螯合親和層析是基于蛋白質分子表面的組氨-酸的咪唑基、半胱-氨酸的巰基和色-氨酸吲哚基能與Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+等金屬離子形成穩定的配位結合而進行生物大分子分離純化的過程。其中，以Ni2+為螯合離子來純化6個或更多組-氨酸組成的Hig-tag標簽蛋白最為常見，本說明書也以該體系為例簡要闡述IDA NUPharose HP的親和原理（圖 1）。

NUPharose基球修飾上IDA配基后，該配體擁有三個配位基團，其中一個氮原子和兩個氧原子可以與Ni2+形成牢固的螯合物。Ni2+可形成6配位數的八面體結構，剩余的三個自由配位點可以與溶劑分子或蛋白質分子結合。Ni2+與組-氨酸標簽蛋白的組-氨酸殘基的咪唑基團配位結合的過程即為金屬螯合填料與目標蛋白的特異性結合過程。提高緩沖液中咪唑的濃度可以將目標蛋白洗脫，洗脫過程中咪唑和目標蛋白競爭與Ni2+的結合。降低pH會影響金屬離子與配體的結合，因此改變pH也是金屬螯合層析洗脫過程的方式之一，但pH不宜低于4，pH過低會將剝離金屬離子。通常也用pH4的醋酸鈉緩沖液清洗螯合Ni2+后的填料，以除去未穩定螯合的Ni2+。

金屬離子親和層析過程的非特異性吸附可能來自離子相互作用、金屬離子與含組-氨酸、半胱-氨酸、色-氨酸的雜蛋白之間的相互作用。前者通過提高緩沖液的離子強度得到抑制，通常添加500mM的NaCl；后者可在上樣緩沖液中添加少量的咪唑（例如~5mM）或者在沖洗過程中添加咪唑而除去。經過優化，可以得到樣品純度和收率均較高的結果。Ni-IDA NUPharose HP填料在使用過程中Ni2+脫落量少，可連續使用多次。當填料性能明顯下降后可以用EDTA將原金屬離子剝離，重新螯合鎳后再生使用。不同金屬離子對目標蛋白的親和力與特異性不同，Cu2+、Ni2+、Zn2+、Co2+的親和力依次降低（影響產率），特異性依次升高（影響純度），可根據分離需求選定合適的金屬離子。對于大多帶Hig-tag標簽的重組蛋白，Ni2+通常是首先考慮的金屬離子，建議使用螯合Ni2+的Ni-IDANUPharose HP。對于含組-氨酸、半胱-氨酸或色-氨酸的非標簽蛋白，Cu2+的高親和力有利于結合目標蛋白。對于磷蛋白，可考慮使用四價或者三價離子。值得注意的是，上述規律不總是成立，需根據目標蛋白篩選合適的金屬離子。

4 、使用方法參考

 4.1  色譜柱裝填

以下闡述與層析系統連接時，填料的色譜柱裝填方法。

（1）所有需要用到的材料的溫度要與色譜操作的溫度一樣，液體最好做脫氣處理。

（2）填料用量計算：通過沉降定量填料體積，需要的沉降填料體積=柱體積×壓縮比（也稱壓縮因子）。沉降體積是指填料在20%乙醇保存液中自然沉降完-全讀取的穩定體積。IDANUPharose HP 的壓縮比為~1.20。為使達到裝柱比，可通過柱頭下壓的方法，也可以通過高流速壓柱。

（3）填料清洗：將填料懸液充分搖勻后量取相應體積，抽濾除去液體，并用約3倍填料體積的純化水洗滌，重復3次，以除去保存液。

（4）裝柱填料懸液準備：將填料轉移到適當的容器中，加入適量的裝柱液，制成50~75 v%的裝柱填料懸液，使用前攪勻。

（5）裝填前準備：在清洗干凈的層析柱下端加入裝柱液，以除去下墊片及層析柱下 端的空氣，在柱內保留少量的蒸餾水，擰緊下堵頭，調整柱子使其垂直于地面。

（6）裝填：將攪勻后的填料懸液一次性緩慢倒入層析柱內（必要時使用裝柱器）， 為避免引入氣泡，應使之沿層析柱內壁自然流下。將所有填料加入后， 用裝柱液將裝柱 器加滿，擰緊裝柱器上蓋，將柱子與層析系統連接。

（7）壓柱：使柱內填料自然沉降（或50~150 cm/h的低流速下沉降），待填料沉降完-全后（填料與液體的界面清晰），去除裝柱器，裝上上柱頭，并將柱頭下降至界面處；通過高流速（推薦流速見下表，注意柱壓不超過0.3MPa），繼續壓柱至界面清晰穩定，標記界面穩定時的柱高。停泵，打開柱頭上的閥門/堵頭，關閉柱底的閥門/堵頭，下壓柱頭至標記位置下方與壓縮比對應的位置，旋緊柱頭，裝柱完成。裝柱完成后，需用高流速平衡柱內的填料。

4.2  柱效測定和評價

完成裝柱后、使用前可通過柱效測定和評價可以確認層析柱裝填質量。柱效通常用理論塔板高度（HETP）和非對稱因子（As）來評價。

4.3  螯合金屬離子

IDA NUPharose HP 以未螯合金屬離子的形式出售，用戶可以在裝柱完成后再層析柱中螯合金屬離子，螯合過程參照以下步驟。

（1）配制50~200 mM的金屬離子溶液，例如螯合Ni2+通常用NiSO4。螯合Ni2+、 Cu2+、Co2+、Zn2+等不同離子的過程基本相同，需注意控制不同pH條件下不同金屬離子的溶解性，pH過高可導致沉淀。螯合Zn2+時，需控制pH=5.5或者更低；螯合Fe3+時，需控制pH=3.0左右。

（2）用純水清洗色譜柱，純水用量 3~5 CV（柱體積），流速100~200cm/h。

（3）用0.2~0.8 CV 的金屬離子溶液通過色譜柱，流速50~100 cm/h金屬離子過量50%時足夠螯合完-全。例如 IDANUPharose HP可螯合18 μmol Ni2+/mL，用0.6 CV的50mM NiSO4溶液螯合時，Ni2+過量67%。螯合完-全后色譜柱底部的顏色從白色變為螯合特定金屬離子的顏色。

（4）用純水清洗色譜柱除去過量的金屬離子，純水用量至少5CV，流速100~200cm/h。

（5）用20mM醋酸鈉+0.5M NaCl（pH=4.0）緩沖液將螯合不穩定的金屬離子除去，緩沖液用量至少5 CV，流速100~200 cm/h。

（6）可直接用結合緩沖液平衡色譜柱。

在裝柱前螯合金屬離子的過程與上述在色譜柱中螯合一致，可在旋勻儀、反應瓶（釜）中螯合金屬離子，利用過濾器清洗螯合前后的填料。

4.4 平衡與上樣（Equilibration & Loading）

金屬螯合填料與磷酸鹽、Tris-HCl等緩沖體系兼容，其中“20mM PB+500mM NaCl（pH=7.4）"的緩沖體系最為常用。初始的緩沖液稱為平衡緩沖液，記為緩沖液A。緩沖液A的特點為不含或者含少量咪唑，pH在7~8之間居多，呈弱堿性。實際使用過程中，如果上樣料液的體積特別大，從降低成本的角度考慮，可不往料液中添加咪唑和NaCl來抑制非特異性吸附，而是在上樣后進行沖洗來去除雜質。

在上樣前，需用緩沖液A在操作流速下平衡層析柱，該過程通常需要5~10個柱體積的緩沖液A，以電導、pH等檢測信號參數不變且與緩沖液A對應為準。

上樣量可按“mg目標蛋白/mL 填料"來設定，通常為DBC10%的50~80%，例如Ni-IDANUPharose HP產品對重組金黃色-葡萄球菌蛋白A（r-SPA，NRPA04）的DBC10%為~50mg/mL，純化 r-SPA 時的上樣量可為25~4mg/mL。除了DBC10%，也可以測試上樣流穿液中的目標蛋白確定上樣量。上樣前需要對樣品進行離心（10000g 以 上）或/和過濾（0.22或0.45μm）等澄清處理，以免堵塞色譜柱。樣品的pH和鹽濃度可用緩沖液A或濃度更高的母液調節。

上樣后需要3~10個柱體積的緩沖液A再平衡層析柱

4.5  洗雜（Wash）

在緩沖液A中添加5~40mM的咪唑沖洗層析柱，可以將非特異性結合的雜蛋白除去。咪唑濃度越高，雜蛋白被除去得越徹-底，但會降低目標蛋白的收率。洗雜過程咪唑的濃度與不同蛋白的特性相關，可通過階躍洗雜過程（例如5mM、10mM、20 mM……）快速優化洗雜條件。洗雜的體積通常為3~10個柱體積。

4.6 洗脫（Elution）

最-常用的洗脫方式為提高洗脫液中咪唑的濃度（在緩沖液A中加入咪唑），推薦在0~500mM范圍內進行階躍洗脫或者線性梯度洗脫。對于大多數帶組-氨酸標簽的蛋白，200mM的咪唑濃度可以將目標蛋白洗脫完-全。對于一些場合，也可以改變pH，結合較弱的蛋白可在pH6時可洗脫，結合較強的蛋白可在pH6~4時洗脫，需注意pH不能低于4。

4.7 再生（Regeneration）

在多次使用后，需要對填料進行再生。可以選擇0.5~1柱體積200mM EDTA+500 mM NaCl（pH=7）的緩沖液將金屬離子剝離。再用50~200mM的金屬鹽溶液與IDA配基螯合，用純水將過量的金屬離子除去，用20 mM醋酸鈉+0.5 M NaCl（pH=4.0）緩沖液將螯合不穩定的金屬離子除去。金屬離子的重新螯合參照4.3小節。

4.8  在位清洗（CIP）

通常上述的再生過程可將填料徹-底清洗。若發生柱壓升高，或為了避免交叉污染，將金屬離子剝離后可進行在位清洗過程。可采用以下溶劑進行在位清洗：2mol/L NaCl ，1mol/L NaOH、70%乙醇或 30%異丙醇等。在位清洗可有效去除介質上的雜質，反向效果更佳。清洗后需用3~5 柱體積的純水除去上述溶劑。

4.9 填料保存

填料的初始保存液為20%乙醇，使用過后可繼續用20%乙醇保存。保存溫度在2~30 ℃為宜，不可凍存。