實時熒光定量PCR檢測服務的技術

　　實時熒光定量PCR檢測服務是在PCR反應體系中加入熒光染料或熒光探針,利用熒光信號積累實時監測整個PCR反應進程,后通過標準曲線對未知模板進行定量分析,具有操作簡便、快速,高通量,而且高敏感性等特點,該技術在分子診斷、分子生物學研究、動植物檢疫以及食品安全檢測等方面有廣泛的應用。

　　實時熒光定量PCR檢測服務不僅實現了PCR從定性到定量的飛躍,而且與常規PCR相比,具有靈敏度高、特異性強、有效解決PCR污染問題、自動化程度高等特點。目前,該技術已廣泛應用于分子生物學、醫學等學科和基礎研究領域,特別是在現代農業轉基因作物的定性檢測、品系鑒定、轉基因成分含量的檢測中發揮著重要作用。

　　實時熒光定量PCR檢測服務的原理

　　實時熒光定量PCR檢測服務是以熒光共振能量轉移原理為基礎。熒光共振能量轉移原理是當一個熒光分子(供體分子)的熒光光譜與另一個熒光分子(受體分子)的激發光譜重疊時,供體熒光分子自身的熒光強度衰減,受體熒光分子的熒光強度增強。Ct值是指每個反應管內的熒光信號到達設定的閾值時所經歷的循環數。Ct值是實時熒光PCR中一個很關鍵的因素,C代表循環(Cycle),t代表閾值(Threshold)。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數的對數存在線性關系,起始拷貝數越多,Ct值越小。利用已知起始拷貝數的標準品可做出標準曲線。因此,根據熒光探針的發光基團所發出的熒光強度與PCR產物的數量呈對應關系,只要對熒光信號進行“實時”檢測并獲得未知樣品的Ct值,即可從標準曲線上計算出該樣品的起始拷貝數。與普通PCR相比,實時熒光定量PCR檢測服務可以利用熒光信號實時監測PCR反應過程中每一個循環擴增產物的變化,可以對初始模板量進行定量分析。

　　簡單地說,實時熒光定量PCR檢測服務的基本原理就是樣本核酸擴增呈指數增長,在反應體系和條件*一致的情況下,樣本DNA含量與擴增產物的對數成正比,由于反應體系中的熒光染料或熒光標記物(熒光探針)與擴增產物結合發光,其熒光量與擴增產物量成正比,因此通過熒光量的檢測就可以測定樣本核酸量。