Western blot實驗異常分析一覽表

更新時間：2016-09-05

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『無信號』

原因	建議
一抗與二抗不匹配	選擇針對一抗來源種屬制備的二抗；
一抗不識別目的的種屬的蛋白	1)檢查抗體的說明書，適用范圍內(nèi)是否包含目的種屬 2)使用陽性對照來檢查抗體質(zhì)量
一抗或二抗不足，沒有足夠的抗體結(jié)合到目的蛋白	1)降低抗體稀釋倍數(shù)，增加抗體濃度 2)延長孵育時間
封閉劑與一抗有交叉反應	改變封閉劑
抗原不足	1)每個泳道加入20-30ug總蛋白 2)制備樣品要使用蛋白酶抑制物及使用陽性對照
在檢測的組織內(nèi)目的蛋白表達水平低	檢測樣本不表達目的蛋白選擇表達量高的細胞作為陽性對照，用于確定檢測樣本是否為陰性，也可更換細胞系
蛋白轉(zhuǎn)膜效率低	1)利用麗春紅檢測轉(zhuǎn)膜效率;檢查轉(zhuǎn)移裝置是否電極弄反 2)轉(zhuǎn)移前膜是否用甲醇侵泡過
膜過渡洗滌	減少洗滌時間和強度
疊氮鈉抑制二抗活性	二抗稀釋液內(nèi)不用疊氮鈉

Western blot實驗異常分析一覽表

『沒有特異條帶』

原因	建議
細胞系傳代過多后蛋白表達譜發(fā)送變化	1)使用未傳代或傳代次數(shù)較少的細胞系進行樣品制備
蛋白本身有很多修飾	1)查閱文獻，確定目的蛋白是否存在多種修飾
蛋白被消化或者降解	1)蛋白樣品確保未被污染，確保含有蛋白酶抑制劑
所檢測蛋白存在多種剪接體，導致分子量大小不同	1)查閱文獻或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA
一抗或二抗?jié)舛雀?/td>	1)減低抗體濃度
洗滌不夠	1)充分洗滌

Western blot實驗異常分析一覽表

『條帶大小不正確』

原因	建議
目的蛋白被降解	確保蛋白樣品未被污染，確保含有蛋白酶抑制劑
存在不同的剪接體	查閱文獻或者通過搜索數(shù)據(jù)庫來確定該蛋白是否存在多種長度不同的編碼mRNA
重組蛋白	檢測是否存在額外加入的蛋白
特殊蛋白如MDM2等	仔細閱讀抗體說明書

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